附件：高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊審查指導原則（2025年修訂稿）（2025年第16號）.doc

高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及
基因分型試劑注冊審查指導原則
（2025年修訂稿）

本指導原則旨在指導注冊申請人對高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是針對高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

本指導原則適用于高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導原則針對高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊申報資料中的部分內容進行撰寫，其他未盡事宜應當符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關法規要求。

本文所述高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑是指利用包括PCR-熒光探針法或其他分子生物學方法在內的核酸檢測技術，以特定高危型HPV核酸（包括DNA和RNA）序列為檢測目的，對人宮頸脫落上皮細胞進行體外定性檢測的試劑，以確定受試樣本中是否存在高于陽性判斷值水平的高危型HPV病毒，或同時鑒定感染HPV的基因型別。此類試劑在臨床上用于：（1）篩查宮頸細胞學檢查為ASC-US（意義未確定的非典型鱗狀上皮細胞）結果的患者，以確定是否需要進行陰道鏡檢查（以下簡稱ASC-US人群分流用途）；（2）對于30歲及以上的女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，與宮頸細胞學檢查聯合進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理(以下簡稱宮頸癌聯合篩查用途)；（3）對于某年齡段（根據臨床試驗結果而定）女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理（以下簡稱宮頸癌初篩用途）。除此以外，若申請人提出其他的預期用途，則應詳細描述相關的臨床背景信息和該檢測與臨床用途的相關性，并在臨床試驗中充分驗證相關的臨床意義。本指導原則僅針對上述三種預期用途提出相關要求。

這里所述的高危型HPV核酸檢測試劑是指可同時檢測多種高危型HPV但不能對陽性結果進行基因分型的試劑，高危型HPV基因分型試劑是指檢測多種高危型HPV的同時可以對HPV陽性結果進行基因分型的試劑。

本指導原則適用的檢測方法主要指基于核酸檢測的分子生物學技術。如：雜交捕獲法、酶切信號放大法、PCR-熒光探針法、熒光PCR熔解曲線法、轉錄介導的核酸擴增技術以及高通量測序技術等。這些方法在性能評價上可能會略有差異，但在技術指標方面均適用于本指導原則，以下有關注冊申報資料的要求主要針對PCR-熒光探針法提出，其他方法學試劑應針對產品自身特點進行相應補充或修正。

二、注冊審查要點

（一）通用要求

關于本指導原則所述產品的預期用途還有以下幾點需要強調。第一，在年齡＜30歲的女性中，雖然HPV感染率很高，但其自主清除率也很高，因此對于細胞學檢查正常的受試者不建議再采用高危型HPV檢測做聯合篩查，在經過臨床試驗證實的基礎上亦可直接采用高危型HPV檢測作為初篩方法；此類高危型HPV核酸檢測試劑對不同年齡段人群的適用情況應符合相關宮頸癌篩查指南的要求。第二，高危型HPV核酸檢測試劑用于ASC-US人群分流或宮頸癌篩查時，其可覆蓋的HPV基因型別應至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型（共13種），產品亦可同時包含26、66、53、73、82型中的一個或數個型別。根據現有的研究成果，若可檢測的HPV基因型別不能涵蓋上述13種高危型，則可能造成陰性預期值無法達到臨床要求，因此不建議單獨用于上述預期用途。對于基因分型試劑，目前的研究數據已證實16、18型的基因分型檢測用于輔助（宮頸癌篩查中）高危型HPV核酸檢測陽性結果的分析是有臨床意義的，可以進行注冊申請，如申報產品增加其他基因型分型，應闡述其臨床意義，并提供相關臨床證據。第三，低危型HPV一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內病變相關，在宮頸脫落上皮細胞中沒有明確的臨床意義，不適合與高危型HPV聯合檢測，在產品設計時，不應將低危型與高危型檢測作為一個注冊單元。第四，鑒于此類試劑的樣本采集方法不利于量值溯源，無法保證定量檢測結果的準確性，因此建議檢測試劑定位為定性檢測，本指導原則不適用于進行定量或半定量HPV核酸檢測試劑的注冊；第五，根據目前相關診療指南要求，宮頸脫落細胞樣本應采用宮頸采樣刷進行樣本采集。最后，本指導原則只針對與宮頸上皮內瘤變及宮頸癌相關的高危型HPV檢測。

（二）監管信息

1.產品名稱及分類編碼

產品名稱應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關法規的要求，如高危型人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及16/18基因分型試劑盒(熒光PCR法)。根據《體外診斷試劑分類規則》，該產品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840-01-01130/01131。

2.其他信息還包括產品列表、關聯文件、申報前與監管機構的聯系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（三）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產品描述、預期用途、申報產品上市歷史及其他需說明的內容。應詳細說明產品所采用的技術原理及檢測流程。與已上市同類產品進行比較，比較內容包括樣本類型、檢測原理、HPV基因型、檢測靶基因、分析性能和臨床性能等。

與預期用途相關的臨床適應證背景情況應詳述高危型HPV核酸檢測和宮頸癌之間的相關性以及HPV檢測臨床應用的限定要求。

（四）非臨床資料

1.產品技術要求及檢驗報告

注冊申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據產品研制、前期評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻資料，結合產品特性按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求編寫產品技術要求。該類產品作為第三類體外診斷試劑，應當以附錄形式明確主要原材料以及生產工藝要求。

高危型人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑已有國家參考品的，技術要求中應體現國家參考品的相關要求，并使用國家參考品對三批產品進行檢驗。

產品技術要求的相關要求應不低于適用的國家參考品、行業標準相應的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應采用在符合質量管理體系的環境下生產的試劑盒進行所有分析性能研究，提交具體試驗方案、試驗數據、統計分析結果及結論等詳細資料。

如申報產品適用不同的機型，需要對各機型間進行差異分析（工作原理、檢測方法、反應條件控制、信號處理等），并提交在不同機型上進行性能評估的研究或驗證資料。如申報產品包含不同的包裝規格，需要對各包裝規格間的差異進行分析或驗證。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、陰陽性鑒定及濃度等。研究中采用的HPV陽性樣本，應采用合理方法確定其陰陽性和濃度水平，并提交具體的試驗資料。樣本的核酸性質（DNA或RNA）應與產品檢測的靶核酸一致。鑒于HPV病毒尚不能體外培養，可采用臨床樣本或感染HPV的細胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因組DNA（或轉錄RNA）等。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

申請人應對不同的樣本保存液分別完成性能評估，包括檢出限和重復性等，證明不同的樣本保存液不會影響試劑的分析性能。

2.1樣本穩定性

包括采集后未經處理的樣本（如適用），加入樣本保存液的樣本，研究內容包括室溫/冷藏/冷凍保存時間或凍融次數等。如適用不同的樣本保存液，應分別進行研究。

如樣本采集、處理后可不立即進行檢測，還需對提取后核酸的保存條件和穩定性進行研究。
　  2.2適用的樣本類型

列明產品適用的樣本類型。

2.3準確度

可采用企業參考品驗證或方法學比對的方法進行研究。

2.3.1企業參考品驗證

根據主要原材料研究資料中的企業參考品設置情況，采用三批產品對企業參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數據。

2.3.2方法學比對研究

采用方法學比對的方式進行研究，所用樣本類型應與說明書聲稱的樣本類型一致，并涵蓋所有可檢測的HPV基因型。

2.4精密度

應對精密度指標，如標準差或變異系數等的評價標準做出合理要求。應考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進行評價，例如：為期至少20天的檢測，具體方案可參考性能評價相關文件進行。

精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟，每一次檢測均應從核酸提取開始。鑒于模擬樣本并不能體現臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中應同時包含若干臨床樣本。精密度評價應覆蓋檢測范圍內的全部HPV基因型別，其中16/18型應使用臨床樣本，其他HPV基因型可使用模擬樣本。

用于精密度評價的模擬樣本和臨床樣本均應至少包含3個水平：陰性樣本、檢出限水平樣本、中/強陽性樣本，并根據產品特性設定適當的精密度要求，例如：

陰性樣本：不含待測物或待測物濃度為零時，陰性符合率應為100%（n≥20）。

檢出限水平樣本：檢出限水平樣本陽性檢出率應≥95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性符合率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.5檢出限

建議采用梯度稀釋的方式進行檢出限的確定，每個濃度梯度梯度的病毒稀釋液重復檢測，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。其中16/18型需使用臨床樣本進行檢出限的驗證。

應對申報產品聲稱可檢測的HPV基因型分別進行研究。申請人可采用數字PCR、標準曲線等方法進行病毒核酸濃度的確定，應提供檢出限研究用樣本的來源、型別確認及病毒核酸濃度的確定方法及結果。可以copies/mL作為病毒核酸濃度的表示方式。

2.6分析特異性

2.6.1交叉反應

應針對預期用途不包含的其他HPV基因型，可在人類泌尿、生殖道寄生微生物，經性傳播的其他病原體，其他常見病原體等進行交叉反應驗證。用于交叉反應驗證的樣本，除HPV外的其他病原體應盡量采用滅活病原體培養物或臨床樣本。建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常細菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高。如采用其他合理方法定值，應為相當的濃度。

首先應在HPV病毒不同基因型間進行交叉反應驗證，其次采用其他的病原微生物進行驗證（見附表1）。
　　應提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產品說明書的【產品性能指標】項中體現。

此外，建議針對被檢測靶序列與人基因組及可能存在于人類泌尿、生殖道的微生物基因組進行基因序列比對，并提交比對結果，如有同源性序列則應進行交叉反應驗證。

2.6.2干擾試驗

2.6.2.1內源/外源物質干擾
　　應根據所采集樣本類型，針對可能存在的內源/外源物質干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，并針對代表性的HPV基因型（如16、18型），至少在HPV臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。干擾物質的選取應至少包括：血紅蛋白、白細胞、宮頸粘液、陰道避孕藥物、女性衛生用品、陰道用抗真菌藥物、陰道潤滑劑等。對結果進行合理的統計分析，對比添加干擾物質前后的 Ct 值差異。

2.6.2.2病原體干擾

申請人應結合產品適用的樣本類型，充分考慮臨床上容易與HPV病毒合并感染的病原體及與檢測范圍內的HPV基因型存在較高同源性的其他HPV基因型，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）被測HPV基因型檢測的影響，進行病原體的干擾研究。

2.6.2.3競爭性干擾

申請人應充分考慮臨床上常見的HPV不同基因型混合感染的情況，評價高濃度基因型對低濃度基因型檢測的影響。建議申請人結合申報試劑的反應模式，使用同一反應體系內一種基因型低濃度和其他基因型高濃度的情況評估競爭性干擾。競爭性干擾試驗可與檢出限、重復性或其他干擾試驗同時進行。

2.7核酸提取/純化性能
　　在進行核酸檢測之前，建議有核酸（DNA或RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率及抗干擾的研究，必要時可考慮與質量較好的核酸提取試劑進行平行比對。若產品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行檢出限和精密度的驗證。

2.8反應體系

2.8.1樣本采集和處理

詳述樣本保存液、樣本采集方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。如涉及不同的樣本采集方式需進行檢測結果一致性的評價。

2.8.2核酸提取和反應體系

研究確定最佳核酸提取和反應體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR反應試劑和樣本體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。

提交不同適用機型基線和閾值循環數的確定資料。

不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩定性研究

申報試劑的穩定性主要包括實時穩定性、運輸穩定性、開瓶穩定性、機載穩定性（如適用）及凍融次數限制（如涉及）等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4.陽性判斷值研究

對于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cut-off），例如對于熒光PCR法即為Ct值的確定資料。

樣本來源應具有多樣性和代表性，考慮不同年齡、地域、不同時間和感染階段等因素，盡量納入含有干擾物質和其他易引起交叉反應病原體的樣本。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行研究；如采用其他方法進行研究，應說明這種方法的合理性。如結果存在灰區，應提供灰區的確認資料。推薦申請人充分考慮產品用于分流、聯合篩查或初篩用途的性能，確定相應的陽性判斷值。注意應納入包含一定數量CIN2在內的各種組織病理類型的樣本進行研究。

提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括樣本來源機構、性別、年齡、臨床診斷信息、檢測結果等。

提供內標檢測結果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

此類產品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質控品及企業參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備及質量標準等的研究資料、質控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業自制，應提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、生產商提供的質量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。生產商應固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，針對所有檢測范圍內的HPV基因型別進行檢出能力和特異性（如交叉反應）的評價，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數據。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性試驗等。

5.1.2酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別對酶活性、熱穩定性、功能性等進行驗證。

5.1.3脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應提供其純度、濃度、功能性等驗證資料。

5.1.4質控品（對照品）

試劑盒一般包含陰性質控品和陽性質控品。陽性質控品的核酸性質應與待測樣本的靶核酸性質一致，如同為DNA或RNA，其中可不包含所有檢測范圍內的HPV基因型，但應選擇臨床較常見的或風險程度較高的基因型，至少包含16或18型。質控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制。應對陽性的檢測結果（如Ct值）做出明確的范圍要求。提交質控品的原料選擇、制備、定值等的試驗資料。

5.1.5內標

內標（內對照）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸共同提取及擴增。需對內標的引物、探針設計和相關反應體系的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果范圍。

5.1.6企業參考品

該類產品的企業參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。企業參考品的核酸性質（DNA或RNA）應與產品檢測的靶核酸一致，可采用感染HPV的細胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因組DNA（或轉錄RNA）等。企業參考品基質需采用滅活臨床樣本。應提交企業參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認等試驗資料。企業參考品的設置建議如下：

陽性參考品：無論試劑盒能否進行HPV基因分型，均應針對檢測范圍內的全部HPV基因型分別設置。

陰性參考品：主要涉及對交叉反應的驗證，適當納入其他HPV基因型樣本和其他生殖道病原體樣本。

檢出限參考品：可采用檢出限或略高于檢出限的濃度水平，應針對檢測范圍內的不同基因型分別設置。

精密度參考品：應選擇臨床較常見的或風險程度較高的基因型（至少包含16和18型）且包含每個反應管的代表性基因型，可不包含檢測范圍內的全部HPV基因型。至少設置弱陽性的濃度水平。

5.2生產工藝研究資料

介紹產品主要生產工藝，可用流程圖結合文字的方式表述。提交主要生產工藝的確定及優化研究資料。

（五）臨床試驗

該類試劑應通過臨床試驗路徑進行臨床評價，臨床試驗包括產品臨床檢測性能研究和針對預期用途的臨床有效性研究兩部分。臨床試驗應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫療器械臨床試驗質量管理規范》和《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，如相關法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說明該類產品臨床試驗中應關注的重點問題。

1. HPV核酸臨床檢測性能研究設計

1.1臨床試驗方法

申請人應選擇已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品和/或核酸序列測定方法作為對比方法，采用擬申報產品與之進行比較研究試驗，以評價擬申報產品檢測目標HPV基因型的能力。需要注意的是，當擬申報產品的陽性判斷值高于最低檢測限水平時，檢測結果判定為“陰性”的情況包括兩種，其一為待測樣本中存在高于最低檢測限水平的HPV靶核酸，但靶核酸水平低于陽性判斷值；其二為待測樣本中無HPV靶核酸，或靶核酸水平低于最低檢測限水平。在檢測結果的統計分析中應分別列明各種情況，可參考表1。

1.2臨床試驗對比方法選擇

臨床試驗應選擇已上市的同類產品作為對比試劑，評價擬申報產品與已上市同類產品的一致性。對比試劑的選擇應考慮產品預期用途、檢測的高危型人乳頭瘤病毒型別范圍、產品性能等方面應與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性。針對不區分型別的檢測試劑，應采用適當的方法確認納入臨床試驗的陽性病例樣本HPV型別；針對分型檢測試劑，對比方法應能夠充分評價每個型別的臨床檢測性能。選擇已上市同類產品進行臨床試驗時，對比試劑配套使用的核酸提取試劑應滿足其說明書要求。

申請人亦可采用試驗體外診斷試劑與核酸序列測定（Sanger測序）方法進行對比試驗，評價兩種檢測方法的一致性。同時還應納入部分病例與已上市同類產品進行對比試驗。以上兩方面評價結果結合起來共同論證試驗體外診斷試劑的臨床性能。

臨床試驗資料中應對測序方法進行詳細的介紹，應采用公認的靶基因進行測序，針對靶基因的選擇應提供依據。明確檢測過程中配套使用的核酸提取試劑，針對測序方法提交性能驗證數據，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。如測序試驗委托其他機構完成，還應提交由臨床試驗機構委托第三方機構/實驗室開展相關試驗的測序服務合同/協議。

有關核酸序列測定方法的資料要求：臨床試驗中如涉及核酸序列測定方法，則建議對擴增子進行雙向測序。應在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細介紹，并提供以下關于測序試驗的詳細信息及資料。

1)測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

2)測序方法所用引物相關信息，如基因區段選擇，分子量、純度、功能性試驗等資料。

3)對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與擬申報產品的相關性能進行適當比對分析。

4)測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

5)提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。

1.3臨床試驗受試人群的選擇及樣本采集

病例選擇及樣本類型：受試者應包含各種臨床表現的人群，如：宮頸細胞學檢查正常者、宮頸上皮細胞異常者以及診斷為宮頸上皮內瘤變（CIN）和宮頸浸潤癌等的患者，受試者年齡應在產品適用人群的各年齡段（如：<30，30～39、40歲以上等）均有分布。

臨床試驗如因試驗體外診斷試劑與對比試劑/方法由于樣本采集、處理、保存等存在差異，不能使用同一份樣本進行檢測，可針對每位受試者進行兩次樣本采集，并分別進行試驗體外診斷試劑和對比試劑/方法的檢測，兩次采集樣本的順序應遵循隨機原則。需要注意的是，臨床試驗應保證一次樣本采集不會影響下一次樣本采集。

1.4臨床試驗樣本量

建議以與對比方法的比較研究為基礎進行樣本量估算。臨床試驗陽性樣本和陰性樣本數量應分別滿足統計學要求。針對試驗體外診斷試劑與已上市同類產品或Sanger測序法進行對比的試驗，可采用單組目標值法公式分別估算整體最低陽性和陰性樣本例數。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標準正態分布的分數位，P0為評價指標的臨床可接受標準，PT為申報產品評價指標預期值。

其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標準（P0）建議不低于90%。臨床試驗結果中，相關評價指標的95%置信區間下限應不低于預設的臨床可接受標準。當評價指標P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應考慮選擇更加合理的方法進行樣本量估算和統計學分析，如精確概率法等。申請人亦可以選擇其他樣本量估算模型，但應詳述該樣本量估算模型及相關參數設置的科學性、合理性。

臨床試驗中，針對產品檢測范圍內的每種HPV基因型均應具有一定的陽性例數。結合產品臨床性能評價需要及HPV感染陽性率，建議16型陽性不低于100例，18型陽性不低于50例，其他各型別，如能夠分型，建議各型別分別不低于30例；如不能分型，產品能夠涵蓋的各亞型建議分別不低于20例。針對臨床試驗過程中確實難以收集的亞型，在提供相關證據的前提下，病例數可酌情減少。

鑒于此類產品樣本采集過程對檢測結果的準確性至關重要，因此，如產品采用不止一種樣本保存液，則應針對不同的樣本保存液進行同源樣本的比較研究試驗，證明不同的樣本保存液不會影響檢測結果。相關比較研究試驗應在2家以上（含2家）臨床試驗機構進行，樣本例數不少于100例，陽性樣本應有一定例數。

1.5統計學分析

應選擇合適的統計學方法對比較研究試驗的檢測數據進行合理分析。對于此類試劑的比較研究試驗，常選擇交叉四格表的形式總結兩種方法定性檢測結果，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率，并計算95%置信區間，以考察兩種方法檢測結果的一致性。

對于基因分型試劑，臨床試驗中應分別驗證該產品對可鑒別HPV基因型的臨床檢測準確性，針對不同基因型HPV分別完成如上所述的統計學分析。

結果差異樣本的分析和驗證：對于兩種方法檢測結果不一致的樣本，申請人應針對具體情況進行合理分析，必要時選擇其他合理的方法進行驗證，亦可結合患者的臨床病情進行分析。

2.預期用途的臨床有效性研究設計

2.1針對ASC-US人群分流用途

2.1.1臨床試驗方法

申請人應在適合進行宮頸細胞學檢查的女性中，入組宮頸細胞學檢查為ASC-US的受試者，針對入組的ASC-US人群首先采用擬申報產品進行HPV核酸檢測，然后，無論HPV檢測結果如何，均應進行陰道鏡檢查，根據陰道鏡檢查結果，必要時取樣進行組織病理學檢查。建議采用同一份宮頸脫落上皮細胞樣本，或同一時間采集的樣本，進行細胞學檢查和HPV檢測，以避免樣本取材不同帶來的偏差；而宮頸細胞樣本采集與陰道鏡檢查之間的時間間隔不應過長，建議不超過12周。以陰道鏡檢查和組織病理學檢查結果為金標準，評價擬申報產品的臨床性能。應注意，如產品聲稱除16、18型以外其他基因型可以分型，應提供關于其他基因分型具有臨床意義的支持性資料，針對其他可鑒別的型別應保證該型別單獨陽性病例中有≥CIN2病例檢出。

2.1.2臨床試驗受試人群

臨床試驗應前瞻性入組宮頸細胞學檢查為ASC-US的受試者。應避免選取已確定需進行陰道鏡檢查的人群，以免造成入組人群的傾向性，因此臨床試驗應以來自細胞學篩查的人群為主。入組人群應盡量在不同的年齡范圍均有分布（<30、30～39和40歲以上）。

2.1.3臨床試驗病例數

應根據試驗體外診斷試劑靈敏度要求、疾病患病率等對入組樣本例數進行科學的分析和計算，本臨床研究建議以臨床靈敏度為主要評價指標，采用抽樣精度的模型進行樣本量估算。臨床試驗終點為病理學檢查結果≥CIN2。可采用如下公式：

公式中n為陽性病例數量，Z1-α/2為置信度標準正態分布的分位數，P為評價指標預期值，一般不大于95%，臨床試驗總樣本量結合患病率估算。應注意，P和Δ的取值應有充分依據。

2.1.4 統計分析

臨床試驗結果一般以四格表的形式進行總結，并據此計算臨床靈敏度、臨床特異性、陽性預期值、陰性預期值、陽性似然比、陰性似然比，并采用適當的方法計算95%置信區間；數據統計和分析方法參見表2和表3。

臨床試驗結果：通過靈敏度、特異度、陽性似然比和陰性似然比的結果判斷試驗體外診斷試劑用于ASC-US人群分流的臨床性能是否能夠滿足臨床要求。

針對≥CIN2水平的臨床性能評價：

臨床靈敏度= (A4+A5)/(A4+B4+A5+B5)×100%

臨床特異性= (B1+B2+B3)/(A1+B1+A2+B2+A3+B3)×100%

陽性預期值（PPV）=(A4+A5)/(A1+A2+A3+A4+A5)×100%

陰性預期值（NPV）=(B1+B2+B3)/(B1+B2+B3+B4+B5)×100%

陽性似然比=臨床靈敏度/（1-臨床特異性）

陰性似然比=（1-臨床靈敏度）/臨床特異性

針對≥CIN3水平的臨床性能評價：

臨床靈敏度= A5/(A5+B5)×100%;

臨床特異性= (B1+B2+B3+B4)/(A1+B1+A2+B2+A3+B3+A4+B4)×100%

陽性預期值（PPV）=A5/(A1+A2+A3+A4+A5)×100%

陰性預期值（NPV）=(B1+B2+B3+B4)/(B1+B2+B3+B4+B5)×100%

陽性似然比=臨床靈敏度/（1-臨床特異性）

陰性似然比=（1-臨床靈敏度）/臨床特異性

2.2針對宮頸癌聯合篩查用途

2.2.1臨床試驗方法

該部分臨床試驗包括基礎檢測和受試者隨訪兩部分，以下針對兩部分內容分別介紹。

基礎檢測：入組人群應分別接受擬申報產品的HPV檢測，記為基礎檢測數據，其中，若擬申報產品可進行16、18型HPV分型檢測，則16、18型陽性的受試者應立即進行陰道鏡檢查，必要時結合組織病理學檢查，結果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，不再進行下述隨訪，其他受試者進入隨訪程序。

受試者隨訪：隨訪時間建議至少持續三年。基礎檢測結果HPV陽性的受試者每年接受隨訪，HPV陰性的受試者每三年接受一次隨訪，以及在隨訪終點接受隨訪。隨訪中應對受試者進行宮頸細胞學檢查，其中檢查結果為正常者繼續隨訪，結果為≥ASC-US的受試者則應進行陰道鏡檢查，必要時結合組織病理學檢查，結果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，并終止隨訪，其他均應持續至隨訪終點，最終未發展為≥CIN2的受試者判為“陰性”。

2.2.2臨床試驗受試人群

臨床試驗應設置科學合理的病例入排標準，入組的受試人群應為未見上皮內病變或惡性細胞（NILM）的30歲以上女性。病例入組應為前瞻性入組。

2.2.3臨床試驗樣本量

此項臨床試驗的入組人群應盡量在不同的年齡范圍均有分布（30～39和40歲以上）。應根據試驗體外診斷試劑靈敏度要求、疾病患病率等對入組樣本例數進行科學的分析和計算，并根據臨床實際情況對病例脫落比例設定合理要求，隨訪終點為病理學檢查結果≥CIN2。臨床試驗可選擇抽樣精度模型進行樣本量估算，公式如下。

公式中n為陽性病例數量，Z1-α/2為置信度標準正態分布的分位數，P為評價指標預期值，Δ為P的允許誤差大小。臨床試驗結合患病率進行總樣本量估算。

應注意，P和Δ的取值應有充分依據。

2.2.4統計學分析

針對HPV基礎檢測結果為陰性和陽性的受試者分別評價其發展為≥CIN2的絕對風險值和發展為≥CIN3的絕對風險值，計算HPV陽性組相對于陰性組發展為≥CIN2和≥CIN3的相對風險值及95%置信區間，確認產品性能滿足臨床要求。此外，HPV陰性人群的絕對風險值應足夠低，以證明該方法對陰性人群的保護作用。最后，應給出受試人群總體的≥CIN2絕對風險值和≥CIN3絕對風險值。風險值的計算可參考如下方法（表4和表5）：

臨床試驗過程中應注意，如產品聲稱除16、18型以外其他基因型可以分型，針對其他可鑒別的型別應保證該型別單獨陽性病例中有≥CIN2病例篩出。

產品靈敏度會影響接受HPV核酸檢測人群轉診陰道鏡的比例，過高的靈敏度可能使更多的CIN2以下的病例接受陰道鏡，影響產品特異性，如產品靈敏度高于已上市同類產品，需要進行轉診陰道鏡檢測結果＜CIN2人數/轉診陰道鏡檢測結果≥CIN2人數的分析，結果應符合臨床要求。

2.3針對宮頸癌初篩用途

2.3.1臨床試驗方法

該部分臨床試驗包括基礎檢測和受試者隨訪兩部分，以下針對兩部分內容分別介紹。

基礎檢查：所有受試者分別進行HPV檢測和細胞學檢查，作為基礎檢查數據；其中，檢測結果為16/18型陽性的受試者、HPV陽性同時細胞學檢查結果為ASC-US的受試者、細胞學檢查結果＞ASC-US的受試者應立即進行陰道鏡檢查，必要時結合組織病理學檢查，結果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，不再進行下述隨訪，其他受試者進入隨訪程序。

受試者隨訪：隨訪時間至少持續三年。基礎檢查結果除16、18型外其余HPV陽性或細胞學檢查ASC-US的受試者每年接受隨訪，HPV陰性且細胞學檢查為正常的受試者每三年接受一次隨訪，以及在隨訪終點接受隨訪。隨訪方法與上述第2.2.1條所述一致，至少隨訪三年或組織病理學檢查結果為≥CIN2。

2.3.2臨床試驗受試者選擇

申請人應按照此項預期用途所述，隨機選取需接受常規宮頸癌篩查且宮頸細胞學檢查結果未知的女性作為受試者。病例入組應為前瞻性入組。

2.3.3臨床試驗樣本量

可參考2.2.3。

2.3.4統計學分析

可參照上述第2.2.4條所述方法，HPV+組相對于HPV-組應呈現具有顯著性差異的高風險值，NILM組相對于HPV-組應呈現具有顯著差性異的高風險值。此外，HPV陰性人群的絕對風險值應足夠低；同時計算受試人群總體的≥CIN2絕對風險值和≥CIN3絕對風險值。

此項臨床試驗的入組人群同樣應在適用的年齡范圍內不同的年齡段均有分布（<30、30～39和40歲以上），且各年齡段人群均具有一定數量，特別是當該預期用途適用于30歲以下人群時，該年齡段應有一定的陽性樣本量，并針對該年齡段單獨進行數據統計分析，以驗證該試劑的初篩性能。除16、18型外可鑒別型別的要求可參考上述第2.2.4條。

綜上，申請人應分別從HPV核酸檢測準確性和臨床意義兩方面評價產品的臨床性能。若臨床試驗未得到有顯著統計學意義的結果，申請人應考慮陽性判斷值設置是否科學，受試者入組標準是否存在偏差，受試者例數是否足夠，病例脫落比例是否可以接受，或者隨訪年限是否需要延長等因素。同時，值得注意的是，臨床試驗的結果需綜合評價，除了靈敏度、特異性、預期值、似然比、風險值的評價以外，HPV陽性率及CIN檢出率等的統計同樣重要，應符合客觀規律。

3.臨床試驗機構的選擇

應選擇不少于3家（含3家）具備相應條件且按照規定備案的醫療器械臨床試驗機構開展臨床試驗。其選擇應盡量考慮擬申報產品的特點和預期用途，綜合流行病學背景，使臨床試驗機構和受試者的選擇具有一定的地域代表性。且臨床試驗機構應具有分子生物學方法檢測的優勢，試驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節，熟悉評價方案。

為了保證入組受試者代表性和臨床試驗可操作性，可委托社區衛生服務機構、鄉（鎮）衛生院、基層疾病預防控制機構等進行受試者招募，注意應由臨床試驗機構進行委托，臨床試驗機構應對臨床試驗整體質量控制、臨床試驗數據的真實性與合規性負責；臨床試驗中的檢測分析（包括試驗體外診斷試劑檢測、對比方法或臨床參考標準涉及的檢測等）、數據管理及統計分析應由臨床試驗機構完成；受試者招募、知情同意書簽署、樣本采集等基礎操作過程可由社區衛生服務機構等完成；有關任務分工等應在臨床試驗方案中明確，由審查該臨床試驗的倫理委員會審查批準；臨床試驗機構應建立相關管理制度，明確各方職責，加強培訓和管理，確保臨床試驗結果真實、準確、完整和可追溯。

4.倫理學要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則，必須獲得臨床試驗機構倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見及受試者的知情同意書。

5.臨床試驗質量控制

開展臨床試驗前，申請人應與各臨床試驗機構協商制定統一的、科學合理的臨床試驗方案，按照臨床試驗方案組織制定標準操作規程，并進行驗證，以確保臨床試驗操作在各個臨床試驗機構之間的一致性。在整個臨床試驗過程中均應遵循預定的方案，不可隨意改動。臨床試驗應在臨床試驗機構的實驗室內進行，并由本實驗室的技術人員操作，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被剔除均應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性，并在臨床試驗方案中詳細說明樣本編盲和揭盲的操作流程。

關于臨床檢測性能研究的比較研究試驗，各臨床試驗機構選用的對比方法應一致，以便進行合理的統計學分析；在預期用途的臨床有效性研究中涉及宮頸細胞學檢查、陰道鏡檢查及組織病理學檢查，應采用統一判讀標準，保持各臨床研究機構間判讀的一致性；受試者隨訪中樣本脫落的判定標準以及試驗數據分析和統計方法等亦應在各臨床研究機構間保持一致。以上內容均應在臨床試驗方案中有明確、清晰的表述。

臨床試驗開始前，應進行臨床試驗的預試驗，以熟悉并掌握相關試驗方法的操作、儀器、技術性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程均應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

6.臨床證據的形式要求

申請人應按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》《醫療器械臨床試驗質量管理規范》等法規文件要求提交各機構倫理審查意見、臨床試驗方案、臨床試驗小結、臨床試驗報告以及臨床試驗數據庫。

（六）產品說明書和標簽樣稿

產品說明書格式應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求。產品說明書中技術內容應與注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，應以規范格式進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。高危型HPV核酸檢測及基因分型試劑說明書編寫應重點關注以下內容。

1.【預期用途】

高危型HPV核酸檢測及基因分型試劑的臨床意義主要在于對婦女罹患宮頸疾病的風險程度提供信息，以便于臨床醫生結合病人的其他檢查結果進行更加準確的疾病判斷和科學的患者管理。

申請人應根據相關臨床研究結果確定產品的預期用途。一般的，此類產品預期用途描述包含以下幾方面：

（1）該產品用于體外定性檢測女性宮頸脫落上皮細胞中高危型人乳頭瘤病毒（HPV）（列出具體能夠檢測的基因型）核酸（明確檢測靶物質，如DNA、RNA）。明確該產品是否能夠鑒別HPV基因型。

（2）該類產品主要用于：

①篩查宮頸細胞學檢查為ASC-US（意義未確定的非典型鱗狀上皮細胞）結果的患者，以確定是否需要進行陰道鏡檢查；

②對于30歲及以上的女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，與宮頸細胞學檢查聯合進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理；

③對于某年齡段（根據臨床試驗結果而定）女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理。

未做相關臨床試驗的產品應在此項下聲明：由于未做相關驗證，本產品不能用于相關臨床預期用途（按照如上項目描述）。

（3）申請人應在此項下強調：

①如申報產品不包含上述第（2）③條所述的預期用途，則申請人應聲明：此檢測不能獨立或優先于宮頸細胞學檢查應用，不推薦在任何年齡段的人群中單獨使用本檢測進行宮頸癌篩查；此方法不能代替宮頸細胞學檢查。

②年齡＜30歲的女性中，HPV感染率很高，同時自主清除率也很高，因此對這部分人群，如宮頸細胞學檢查正常則不應再采用高危型HPV檢測進行聯合篩查，建議僅采用宮頸細胞學方法進行篩查，或參照上述第（2）③條所述進行篩查。

③本試劑檢測結果應結合宮頸細胞學檢查及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。

④高危型HPV核酸檢測試劑的應用應符合相關臨床診療和篩查指南的要求。

（4）此外申請人還應就以下內容進行簡要介紹：

①臨床背景的介紹，包括病原體生物學特征，基因型劃分，感染后的臨床癥狀及該檢測的臨床意義等。著重說明高危型HPV感染與宮頸癌的相關性，描述應客觀、科學、全面。

②說明申報產品選擇高危型HPV基因型的依據和考慮。原則上建議選擇至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68基因型在內的多基因型聯合檢測的設計方式，以保證該產品用于宮頸癌篩查及風險評估的能力，亦可同時包含26、53、66、73、82型中的一個或數個型別。不應包含其他低危型HPV。

2.【檢驗原理】

詳細說明試劑盒技術原理，及核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位；介紹引物及探針設計、不同靶核酸反應體系（管）組合、質控品（對照品）設置及熒光信號標記等。如添加了相關的防污染組分，也應對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及主要成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產品名稱，生產廠家，貨號及注冊證號、備案號等信息。

4.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等。應與相應的穩定性研究結論一致。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【樣本要求】 

明確適用的樣本類型。詳細描述樣本采集及預處理要求、運輸要求、保存條件及時間等。樣本采集所需設備及保存液，需明確供應商、貨號及注冊證號（如有）。

若有通用的樣本的采集及處理方式的技術規范或指南，應遵循并引用。

7.【檢驗方法】

詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項，質控品（對照品）參與樣本核酸的平行提取等。

7.3擴增反應前準備：各組分加樣體積及順序等。

7.4逆轉錄過程（如涉及）的溫度和時間、PCR各階段的溫度和時間、循環數等。

7.5儀器設置：各適用機型的反應參數設置等。

7.6質量控制：明確質控品和內標的檢測結果范圍，作為實驗有效性的標準。
    8.【陽性判斷值】

總結陽性判斷值研究方法及結論。

9.【檢驗結果的解釋】

結合質控品（對照品）以及樣本管中靶基因和內標的檢測結果，列明結果陰性、陽性、復測、無效等所有情形。

如有適用的臨床診療或篩查指南，則應在此項下引用，相應檢驗結果的解釋應符合相關指南的要求。

10.【檢驗方法的局限性】

10.1本試劑檢測結果應結合宮頸細胞學檢查及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。

10.2 不合理的樣本采集、轉運及處理、以及不當的實驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。

11.【產品性能指標】詳述以下性能指標：

11.1國家參考品（如有）和企業參考品的符合情況。

11.2檢出限：說明每種HPV基因型的檢出限，簡要介紹評價方法、所用樣本情況。

11.3精密度：詳細描述針對各種HPV基因型，采用不同來源的樣本（如人工模擬樣本和臨床樣本）在各個濃度水平進行的精密度評價結果，可采用列表形式描述。

11.4分析特異性：

交叉反應：說明經過交叉反應驗證的病原體名稱、交叉反應性及其驗證濃度水平。

干擾試驗：說明潛在干擾物質的評價濃度水平及干擾情況，病原體干擾及競爭性干擾情況。

11.5臨床試驗：簡要介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結果和結論等。

12.【注意事項】應至少包括以下內容：

12.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出生物安全性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

12.3強調產品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產品性能。

三、參考文獻

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附表1